Abstract:

Im Rahmen des Sulfosys-Projekts wird die Auswirkung von Temperaturänderung auf ein metabolisches netzwerk auf Transcriptom, Metabolom, Proteom und Enzymebene untersucht. S. solfataricus nutzt einen ungewöhnlich verzweigten Entner-Doudoroff (ED) Weg für den Zuckerabbau, der sowohl Glukose als auch Galaktose verarbeitet. Als Teil des SulfoSYS-Projekts konzentriert sich diese Arbeit auf die Charakterisierung der folgenden Enzyme Glucose-Dehydrogenase (GDH-2, SSO3204), Phosphoglycerat Mutasen (iPGAM, SSO0417 und dPGM, SSO2236), Enolase (ENO, SSO0913), Pyruvatkinase (PK, SSO0981), Phosphoenolpyruvat-Synthetase (PEPS, SSO0831), Pyruvat Dikinase (PPDK, SSO2820), bestehend aus Klonierung, Expression und detallierter Analyse der Aktivität bei verschiedenen Temperaturen zwischen 50°C bis 88°C. Darüber hinaus wurden zellfreie Extrakte aus S. solfataricus Zellen hergestellt die bei den Temperaturen 65°C, 70°C und 80°C gewachsen sind und auf Enzymaktivitäten hin untersucht. Des Weiteren wurden temperaturabhängige Stabilitäten von Intermediaten bestimmt. GDH-2, ENO, PK und PEPS waren nur als putative enzyme im S. solfataricus Genom annotiert, diese wurden im Detail charakterisiert und konnten in dieser Arbeit als funktionelle Enzyme bestätigt werden. Für die S. solfataricus iPGAM konnte gezeigt werden dass diese zusätzlich zur bereits bekannten katabolen auch in die anabole Richtung aktiv ist. Der Vergleich kinetischer Parameter zeigt, dass GDH-2 den Grossteil der Verarbeitung von Glukose übernimmt, während GDH-1 flexibler ist und eine ganze Reihe an verschiedenen Zuckern als Substrat nutzt. Die kinetischen Parameter von iPGAM, ENO, PK und PEPS weisen interessante Trends bezüglich der Temperaturänderung auf und zeigen dass jedes der untersuchten Enzyme unterschiedlich auf die Änderung der Temperatur reagiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Intermediate PEP, NADH und NADPH hitzelabil sind, wodurch eine metabolische Thermoadaptionsstrategie für den Organismus S. solfataricus notwendig ist. Diese Erkentnisse und die Tasache, dass iPGAM und ENO unterschiedliche Präferenzen in anaboler und kataboler Richtung der Enzymreaktion aufweisen, legt eine Anpassung an hohe Temperaturen nahe, bei der der Flux von hitzelabilen Intermediaten gesteuert wird. Die Produktion von PEP durch ENO wird bei hohen Temperaturen verlangsamt und gleichermassen die umwandlung von PEP zu pyruvat beschleunigt, wodurch kleinere Mengen des hitzelabilen Intermdiats PEP der hohen Temperatur ausgesetzt sind. Darüber hinaus wird die anabole Reaktion von PEP hin zum hitzestabilen 2-PG bei höheren Temperaturen bevorzugt. Die Untersuchungen der zellfreien Extrakte von S. solfataricus Zellen weist eine Substrat und Co-substratnutzung der GDH-Reaktion auf, die vermuten lässt das noch ein weiteres Enzym an dieser Reaktion beteiligt ist, möglicherweise eine Galaktose Dehydrogenase oder ein drittes GDH-Isoenzym. Die kinetischen Parameter aus zellfreien Extrakten und rekombinant exprimierten Enzymen wurden zur erstellung des ersten kinetischen ZKM Modell für einen thermoacidophilen Archaeum verwendet. Ziel des Projektes ist, eine ausreichend präzise Nachbildung des ZKM von S. solfataricus („Silicon Cell“) zu erstellen, die es erlaubt, die Robustheit des Netzwerkes gegenüber Temperaturveränderungen zu berechnen und modellieren. Das Modell ist unter folgendem Link zu finden: http://jjj.biochem.sun.ac.za/sysmo/models/Sulfo-Sys/index.html