Abstract:

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Bedeutung von Tumor Nekrose Faktor alpha (TNF alpha), Interleukin-1 beta(IL-1 beta) und S-Nitrosoglutathion (GSNO) für die Hypoxie-induzierte Erythropoietin-Bildung in der humanen Neuroblastom-zelllinie Kelly durchgeführt. Erythropoietin (EPO) wurde mittels Enzyme-linked-immuno-sorbent-assay (ELISA) und als biologisch aktives Protein im Bioassay gemessen, die EPO-Botenribonukleinsäure (mRNS) wurde mittels qualitativer und quantitativer Polymerasekettenreaktion (PCR) ermittelt, die Transkriptionsfaktoren Hypoxie-induzierbarer Faktor-1 alpha (HIF1-alpha), AhR Nuclear Translocator1 (ARNT1) und Nuclear Factor kappa B (NF kappa B) in Western-Blot-Analysen nachgewiesen und die transkriptionelle Aktivität von HIF-1 im Luciferase-Reportergenassay analysiert. Zytokine reduzieren auf mRNS-Ebene in beiden Zelllinien den Gehalt an EPO-mRNS. Die Wirkung von TNF alpha ist hier am deutlichsten. Die Messung des sezernierten EPOs zeigt, dass - im Vergleich zu den HepG2 -Zellen, bei denen die stärkste Hemmung unter IL-1ß erfolgt, - in den Kelly-Zellen die EPO-Bildung um 8% unter IL-1ß, um 27% unter GSNO und um 35% unter TNF alpha sinkt. Western-Blot-Analysen weisen in Kelly-Zellen unter Einfluss von IL-1ß und GSNO im Vergleich zur hypoxischen Kontrolle eine deutliche HIF-1 Akkumulation im Kern auf, während TNF alpha die Stabilisation von HIF-1 alpha nicht verändert. TNF alpha reduziert die HIF-1 Aktivierung in Reportergenassays, während IL-1ß diese steigert und GSNO ohne signifikanten Einfluss bleibt. In HepG2 ist bekannt, dass IL-1ß und TNF alpha zu einer verstärkten HIF-1 alpha Akkumulation führen, jedoch eine Hemmung der EPO-Bildung erfolgt. Diese Verminderung wird zum Teil auf eine Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF kappa B zurückgeführt. In Kelly-Zellen bewirkt GSNO nur eine geringe Zunahme der Aktivität von NF kappa B im Zellkern, während TNF alpha und IL-1ß NF kappa B stärker aktivieren. Da Zytokine die EPO-Genexpression in den Kelly-Zellen nicht so stark reduzieren wie in den HepG2, müssen weitere Wege der Signaltransduktion an der EPO-Expression in neuronalen Zellen beteiligt sein.