Abstract:

Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Glykosylierung des middle surface antigen des Woodchuck Hepatitis Virus untersucht werden. Dazu wurden chimäre Proteine aus der WHVpreS2/S-Region und dem S-Antigen von HBV mit der HBV ´a´-Determinante konstruiert. In der preS2-Region konnte durch zielgerichtete Mutagenese und in vitro Translations-Assays eine O-Glykosylierungsstelle an Position 5 (Thr) der Aminosäuresequenz identifiziert werden. Mit Hilfe von Immunfluoreszenzfärbungen und Konfokalmikroskopie wurde gezeigt, daß die Glykosylierung des preS2-Proteins eine wichtige Rolle für den intrazellulären Transport dieses Proteins spielt. Dabei wurde deutlich, daß falsche oder fehlende Glykosylierung zu einer ringförmigen Anreicherung des preS2-Proteins führt. Diese Ringbildung erfolgt nach den vorliegenden Daten zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat, also in dem zellulären Kompartiment, das für die O-Glykosylierung verantwortlich ist. Dies ist eine mögliche Erklärung für den Erfolg einer Therapie mit Glykosylierungsinhibitoren. Vergleichende Studien mit einer preS2-minus Chimäre zeigten, daß die Ringbildung nur bei fehlender Glykosylierung des preS2-Proteins auftritt, nicht aber bei nicht-Translation der preS2-Domäne. Der Therapieerfolg mit Glykosylierungsinhibitoren im Falle einer Infektion mit HBV-Varianten, denen das preS2-Protein fehlt, ist also fraglich. Desweiteren sollte die Replikationskompetenz von WHV-Stämmen mit Glykosylierungsdefekt sollte mit Hilfe in vivo Transfektionen untersucht werden. Im Rahmen dieser Versuche konnte jedoch allenfalls die kurzfristige Expression viraler Proteine nachgewiesen werden, nicht aber die Replikation der glykosylierungsdefekten oder preS2minus Mutante. Ein Virustiter und damit Replikation konnte nicht nachgewiesen werden, und zwar weder für die preS2minus-Mutante, noch für die Variante mit dem Glykosylierungsdefekt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine RNase Protection Assay etabliert. Mit Woodchuck-spezifischen Sonden, sogenannten Riboprobes, kann die Expression der Cytokine IFN-g, TNF-a und IL-15 sowie der T-Zellmarker CD3, CD4 und CD8 qualitativ und quantitativ untersucht werden. Es wurde gezeigt, daß die Marker CD3, CD4 und CD8 während der chronischen Infektion stärker exprimiert werden als in der Akutphase der Infektion. Alle untersuchten Cytokine und T-Zellmarker sind während der chronischen Infektion natürlichen Schwankungen unterworfen. Ausgehend von einem Mittelwert betragen diese Schwankungen ± 50%, gemessen in DLU. Diese Fluktuationen sind zehnmal so hoch wie die Schwankungen, die man beobachtet, wenn man zu einem einzigen Zeitpunkt multiple Biopsien aus verschiedenen Regionen einer einzigen Leber untersucht. Ebenfalls konnten unterschiedliche Expressionsmuster bei verschiedenen Tiere beobachtet werden. Der RNase Protection Assay konnte bereits in mehreren Projekten erfolgreich zur Untersuchung der Cytokin- und T-Zellmarker-Expression eingesetzt werden. So konnte gezeigt werden, daß das Immunmodulans a-Galaktosyl-Ceramid Spezies-spezifisch wirkt, und im Woodchuck nicht zu einer Erhöhung der Interferon-g Expression führt. Mit Hilfe des RPA konnte darüber hinaus die Erhöhung der CD4, CD8 und Interferon-g Expression nach einer Tumortherapie mit einem rekombinanten Adenovirusvektor nachgewiesen werden. Die Erhöhung der Expression dieser Marker erfolgte durch einen Gentransfer der Gene für IL-12 und B7.1. Darüber hinaus sind seit kurzem Interferon-a und GAPDH aus dem Woodchuck als Konstrukte für den RNase Protection Assay verfügbar (Daten nicht gezeigt, Klonierung erfolgte analog zu 3.14), wodurch weitere Untersuchungen der Woodchuck-Immunantwort ermöglicht werden. Durch die Expression des Interferon-g-Rezeptors des Murmeltiers wurde der Grundstein für weitere Untersuchungen der Interferon-g Wirkung gelegt. Aufgrund der bisherigen Daten müßte es daher in absehbarer Zukunft möglich sein, weitere immunologisch-virologische Studien der hepadnaviralen Infektion im natürlichen Infektionsmodell durchzuführen.