Weski, Juliane:
Das Netzwerk der periplasmatischen Proteinqualitätskontrolle in E. coli
Duisburg, Essen, 2010
2010Dissertation
BiologieFakultät für Biologie
Titel:
Das Netzwerk der periplasmatischen Proteinqualitätskontrolle in E. coli
Autor*in:
Weski, JulianeUDE
LSF ID
51882
Sonstiges
der Hochschule zugeordnete*r Autor*in
Akademische Betreuung:
Ehrmann, Michael
Erscheinungsort:
Duisburg, Essen
Erscheinungsjahr:
2010
Umfang:
143 Bl.
DuEPublico 1 ID
Signatur der UB:
Notiz:
Duisburg, Essen, Univ., Diss., 2010

Abstract:

Jede Zelle besitzt tausende verschiedene Proteine, die sich in einer Vielzahl von Eigenschaften unterscheiden. Um sicher zu stellen, dass alle Proteine aktiv sind und im richtigen zellulären Kompartiment vorliegen, hat die Evolution effiziente Kontroll-mechanismen hervorgebracht. Als Modell zur Untersuchung dieser elementaren Mechanismen eignet sich das Periplasma von E. coli, denn es besitzt alle für die Proteinqualitätskontrolle wichtigen Faktoren (Chaperone, Proteinfaltungskatalysatoren und Proteasen). Obwohl Struktur, Funktion und Regulation der einzelnen periplasmatischen Faltungsfaktoren gut untersucht sind, ist über ihre mögliche Organisation in Faltungswege oder Netzwerke kaum etwas bekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, erste Einblicke in bisher unbekannte Netzwerke der Proteinqualitätskontrolle zu erlangen und ihre Schlüsselelemente zu identifizieren. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Herstellung und Charakterisierung von E. coli-Mutanten lieferte zahlreiche Erkenntnisse, die zum besseren Verständnis der periplasmatischen Proteinfaltung beitragen. Durch die Herstellung synthetisch letaler Phänotypen erlangten Rizzitello et al. erste Erkenntnisse zur Organisation von periplasmatischen Faltungsfaktoren. Deletionsstudien ergaben letale Kombinationen für Nullmutationen in surA und skp bzw. surA und degP. Da nur diese beiden Paarungen synthetisch letale Phänotypen ergaben, die skp degP-Doppelmutante jedoch gänzlich unauffällig war, folgerten Rizzitello et al., dass es sich bei SurA und DegP bzw. Skp um redundante Faktoren handelt, die in zwei unterschiedlichen Faltungswegen organisiert sein müssen (Rizzitello, 2001). Zur Charakterisierung möglicher Faltungswege der Proteinqualitätskontrolle wurden daher im Rahmen der vorliegenden Arbeit 84 Mutanten konstruiert, die jeweils zwei ausgewählte Faltungsfaktoren nicht exprimieren. Die Identifizierung letaler Kombinationen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen (optimale Bedingungen, verschiedene Stressbedingungen) und die Charakterisierung der Membranintegrität aller Doppel-KO-Stämme ergab 11 synthetische Phänotypen bzw. genetische Interaktionen, die Einfluss auf die Proteinqualitätskontrolle der Zellhülle besitzen. Anhand dieser Interaktionen konnten Rückschlüsse auf funktionelle Redundanzen der entsprechenden Genprodukte und ihre mögliche Organisation in verschiedene Faltungswege gezogen werden. Die 11 auf diese Weise identifizierten Doppelmutanten, wurden anhand von Untersuchungen zu metabolischen Prozessen und durch qRT-PCR-Analysen genauer charakterisiert. Die Ergebnisse dieser Studien konnten die Bedeutung der genetischen Interaktionen von degP dsbA, degP tsp, surA dsbA, surA ptrA, surA yfgC, dsbA fkpA und tsp ydgD für die Proteinqualitätskontrolle belegen. Zudem wurden SurA, DegP, Tsp und DsbA als Schlüsselelemente von Proteinfaltungsprozessen identifiziert, denn an jedem Phänotyp, der auf deutliche Faltungsdefekte hinwies, war entweder eine Nullmutation in surA, degP, tsp oder dsbA beteiligt. Mögliche funktionelle Redundanzen der verschiedenen Faltungsfaktoren ließen sich größtenteils auf Proteinebene bestätigen. So konnten durch Western Blot-Analysen gemeinsame Substrate für die Prolinisomerase SurA und die Metalloproteasen PtrA bzw. YfgC, sowie für die Serinprotease DegP und die Oxidoreduktase DsbA bzw. die Serinprotease Tsp identifiziert werden. Darüber hinaus konnten anhand dieser Methode weitere genetische Interaktionen von degP belegt werden, die in den vorhergehenden Untersuchungen der vorliegenden Arbeit keine Besonderheiten zeigten. So besitzen die Prolinisomerase PpiD und die Metalloprotease YfgC ebenfalls gemeinsame Substrate mit DegP. Eine mögliche redundante Funktion von DegP und Tsp konnte zusätzlich durch biochemische Analysen, wie Aktivitätstests und Studien zur Sequenzspezifität von PDZ-Domänen bestätigt werden. Die im Rahmen dieser Arbeit identifizierten Redundanzen lassen eine strikte Trennung der untersuchten Faltungsfaktoren in starre Faltungswege nicht zu. Vielmehr belegen die Ergebnisse erstmals, dass die Proteinqualitätskontrolle als flexibles Netzwerk organisiert ist, dass sich in Abhängigkeit von Umweltbedingungen an die jeweiligen Substrat anpasst. SurA, DegP, Tsp und DsbA könnten als zentrale Elemente die einzelnen Zweige des dynamischen Faltungsnetzwerks miteinander verbinden. Diese ersten Einblicke in das bisher unbekannte Netzwerk der