Abstract:

Der südafrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis ist ein attraktives Modell, um die frühe Entwicklung von Vertebraten auf molekularer und zellularer Ebene zu untersuchen. Die Transparenz der Larven ermöglicht eine effiziente Beobachtung der zahlreichen morphologischen Veränderungen während der Organogenese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des gewebespezifischen Transkriptionsfaktors HNF1β insbesondere in der Nierenentwicklung von Xenopus laevis näher charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde das binäre Cre/loxP-System mit Aktivator- und Effektorstämmen verwendet. In diesem System kann die Cre-Rekombinase konditional durch einen Hitzeschock aktiviert werden. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass die Transkription der Cre-Rekombinase sowohl im HSPCre1- und im HSPCre13-Aktivatorstamm durch einen einstündigen Hitzeschock effizient aktiviert wird und beide Stämme als Aktivatorstämme für das Cre/loxP-System verwendet werden können. Durch Kreuzung des C5-Stammes mit dem HSPCre1-Stamm wurde gezeigt, dass bereits eine Stunde nach Beginn des Hitzeschocks Transkripte eines induzierbaren Reportergens detektierbar waren. Die HSPCre13 vermittelte Überexpression der P328L329del-Mutation durch einen einstündigen Hitzeschock führte zu Nierendefekten und Fehlentwicklungen anderer Organe. Es wiesen jedoch nicht alle mutanten Larven Nierendefekte auf. Dieses Ergebnis konnte in weiteren Kreuzungen mit unabhängigen Aktivator- und Effektorstämmen bestätigt werden. Nach der Optimierung des binären Cre/loxP-Systems durch einen zweistündigen Hitzeschock konnte gezeigt werden, dass die ubiquitäre Überexpression der P328L329del- Mutation in allen mutanten Larven zu einem Nierenphänotyp führte. Insgesamt war die Niere signifikant verkleinert. Zusätzlich interferierte die Überexpression mit der Entwicklung des Magen-Darm-Traktes, des Schwanzes und des Auges. Durch die Analyse ausgewählter Marker für die einzelnen Segmente des sich entwickelnden Pronephros konnte gezeigt werden, dass die Überexpression des mutanten Derivates P328L329del die Expression der Gene slc3a1 und tmem27, welche spezifisch in den proximalen Tubuli exprimiert werden, beeinflusste. Beide Gene spielen eine Rolle bei der renalen Reabsorption von Aminosäuren. Dieses Resultat enthüllt eine neue Rolle von HNF1β in der Nierenphysiologie. Larven in denen das mutante HNF1β-Derivat A263insGG ubiquitär aktiviert war, wiesen ebenfalls Defekte der Niere, des Magen-Darm-Traktes, des Schwanzes und des Auges auf. Im Gegensatz zu dem durch die Überexpression von P328L329del verursachten Nierenphänotyp, war die Niere hier signifikant vergrößert. Die Überexpression von HNF1β hatte hingegen keinen Einfluss auf die Larvenentwicklung. Desweiteren konnten zwei neue Effektorstämme etabliert werden, mit denen HNF1β und das mutante Derivat P328L329del im Gegensatz zu den vorherigen Experimenten ausschließlich im Pronephros überexprimiert werden können. Es konnte gezeigt werden, dass die pronephrosspezifische Überexpression von HNF1β mit der Entwicklung der Niere und des Magen-Darm-Traktes interferierte. Im Schwanzbereich und im Auge wurden keine Defekte beobachtet. Weiterhin wurde eine neue Methode in Xenopus laevis getestet und optimiert, bei der die lokale Hitzeschockaktivierung eines Gens mittels Laserbestrahlung erfolgt. Mit dieser Methode war es möglich, das EYFP-Reportergen des C5-Stammes lokal in einzelnen Schwanzmuskelzellen und im Pronephros zu aktivieren. Diese Methode wurde in dieser Arbeit erstmalig in Xenopus laevis angewandt und ermöglicht eine gewebespezifische Überexpression von Genen ohne die Verwendung gewebespezifischer Promotoren.