Abstract:

Der Mechanismus und die komplexen Regulationsnetzwerke des zentralen Kohlenhydratmetabolismus von T. tenax stehen seit einigen Jahren im Mittelpunkt der Forschung unserer Arbeitsgruppe. Ein wesentliches Anliegen der vorliegenden Untersuchungen bestand darin, den ersten Schritt des anabolen EMP-Weges, d.h. die Synthese von Phosphoenolpyruvat (PEP) aus Pyruvat zu charakterisieren. Die Identifizierung einer PEP Synthetase (PEPS)-Aktivität in zellfreien Extrakten von T. tenax [Siebers, 1995] wurde im Zuge dieser Arbeit durch Klonierung und Sequenzierung des codierenden Gens (pps) bestätigt. Überraschenderweisende wurde zusätzlich ein Leserahmen identifiziert, der für ein bis dahin ausschließlich auf die Domänen Eucarya und Bacteria beschränktes Enzym, die Pyruvat, Phosphat Dikinase (PPDK) codiert: Dieses Enzym katalysiert in einer mit der PEPS vergleichbaren Reaktion de Interkonversion von Pyruvat und PEP. Mit dem Ziel, durch einen direkten Vergleich der katalytischen und regulativen Fähigkeiten von PEPS und PPDK diese ungewöhnliche Coexistenz zu erklären, wurden beide Enzyme heterolog in E. coli exprimiert und sowohl funktionell als auch strukturell charakterisiert. Die PEPS von T. tenax katalysiert in einer irreversiblen Reaktion die Umsetzung von Pyruvat und ATP zu PEP, AMP und P i. Durch gezielte Mutagenese konnte der Histidin-Rest an Position 406 des Enzyms als katalytisch essentieller Rest identifiziert werden, der am Phosphorylgruppen-Transfer von ATP auf Pyruvat beteiligt ist. Die aus der reversiblen Phosphorylierung des katalytischen Histidin-Restes resultierenden Isoformen der PEPS (phosphoryliert / dephosphoryliert) zeichnen sich durch unterschiedliche Mobilität in der SDS-PAGE aus. Unter nativen Bedingungen bildet die T. tenax PEPS - wie die Enzyme der hyperthermophilen Archaea P furiosus und S. marinus - einen multimeren Proteinkomplex aus.Im Gegensatz dazu liegt die mesophile E. coli PEPS als homomeres Dimer vor. Dieser Befund steht im Einklang mit der ber hyperthermophilen Organismen häufig beobachtbaren Tendenz zur Bildung höherer Oligomerisierungsformen von Enzymproteinen, die im Zusammenhang mit der Anpassung an extrem hohe Temperaturen diskutiert wird. Wie am heterolog in E. coli exprimierten Enzym untersucht, zeichnet sich PEPS durch ein großes regulatorisches Potential aus: So wirken vor allem alpha-Ketoglutarat, AMP und ADP, in geringerem Maße auch GAP, DHAP, 3-PG und P i inhibierend auf die Umsatzgeschwindigkeit des Enzyms. Die PPDK von T. tenax katalysiert die reversible Umsetzung von Pyruvat, ATP und P i zu PEP, AMP und PP i. Die enzymatische Eigenschaften der PPDK lassen allerdings eine deutliche Bevorzugung der katabolen Reaktion (Pyruvat-Synthese), die offenbar nicht auf Protein-Ebene reguliert wird, wurde für die katabole Reaktion eine Inhibierung der Umsatzgeschwindigkeit durch ATP, UDP und Glc-1-P festgestellt. Die T. tenax PPDK liegt nach vorliegenden Untersuchungen als homomeres Dimer vor und ist damit den bacterialen Enzym-Homologen ähnlicher als den PPDKs aus Pflanzen und Protozoen, die ausschließlich homomere Tetramere bilden. Mit der strukturellen und funktionellen Charakterisierung der PEPS und der ersten archaealen PPDK konnte in dieser Arbeit im unteren Abschnitt des EMP-Weges eine wichtige Schaltstelle des Kohlenhydratmetabolismus von T. tenax identifiziert werden, die über die Richtung des Kohlenstoff-Fluxes in der Zelle entscheidet. Dabei ist die PEPS aufgrund ihrer unidirektionellen Reaktion als strikt anaboles Enzym festgelegt, während die PPDK vornehmlich eine katabole Funktion innerhalb des EMP-Weges erfüllt. Beide Enzyme werden durch den Energiestatus der Zelle sowie durch verschiedene Intermediate des Kohlenhydratmetabolismus auf Proteinebene reguliert. Die katabole Reaktion der PPDK ergänzt dabei die katalytischen und regulativen Fähigkeiten der PK. Northern Blot-Analysen weisen darauf hin, daß die codierenden Gene der PEPS und PPDK während des expotentiellen Wachstums von T. tenax unter autotrophen und heterotrophen Bedingungen gleich stark exprimiert werden. Der eher überraschende Befund einer konstitutiven Expression wird damit erklärt, daß beide Enzyme bei einer Veränderung der trophischen Bedingeungen möglichst unmittelbar für die entsprechend geforderte Reaktionsrichtung zur Verfügung stehen sollten und damit ausschließlich auf Proteinebene reguliert werden. Die konstitutive Expression läßt zudem die Möglichkeit offen, daß die PEPS auch unter heterotrophen, die PPDK auch unter autotrophen Bedingungen katalytisch aktiv ist: So kann die PEPS unter heterotrophen Bedingungen möglicherweise über einen 'futile cycle' mit der PK und/oder PPDK als Ventil für überschüssige Energie wirken ('energy spilling'), während die PPDK bei einem Energie-Notstand unter autotrophen Bedingungen als 'stand-by' Enzym ATP-Synthese über den Abbau interner C-Quellen (Glykogen) erlaubt. Im Gegensatz zur logarithmischen Wachstumsphase wird in der stationären Wachstumsphase bei heterotroph gezogenen T. tenax-Zellen eine deutliche Reduktion der pps-Transskripte beobachtet, die dafür spricht, daß die Transskription des Gens unter einer übergeordneten, Wachstumsphasenabhängigen Kontrolle steht. Möglicherweise soll unter Bedingungen, die eher durch Energie-Mangel der Zelle ausgezeichnet sind und damit ein Energie-Ventil als überflüssig erscheinen lassen, die Energie für die Expression der PEPS gespart werden. In einem weiteren Projekt dieser Arbeit wurde die bis dahin unvollständige genetische Information eines acn-tpi-cis1-Genclusters durch Klonierung und Sequenzierung der flankierenden Bereiche komplettiert. Untersuchungen zur Transkriptiondes ungewöhnlichen Genclusters haben gezeigt, daß das codierende Gen der Citrat Synthase 1 als monocistronische mRNA abgelesen wird. Die verstärkte Expression von Aconitase und TIM unter heterotrophen Wachstumsbedingungen spricht dabei für eine Regulation auf Transkriptebene in Abhängigkeit von der angebotenen Kohlenstoff-Quelle. Die gemeinsame Transkription von Genen des EMP-Weges (tpi) und des TCA-Zyklus (acn) wird als starkes Indiz für eine enge funktionelle Kopplung und direkte Koordination der reversiblen Soffwechselwege gewertet.