Abstract:

Die Methylierung von Metall(oid)en ist in der Umwelt ein weit verbreitetes Phänomen und erfolgt durch den abiotischen als auch enzymkatalysierten Transfer einer Methylgruppe. Während in vielen Bakterien und Säugetieren S-Adenosylmethionin (SAM) die Hauptquelle für diese Methylgruppen darstellt, kann bei anaeroben Mikroorganismen, wie den Methanoarchaeen, Methylcobalamin (CH3Cob) als Methyldonor dienen. Verschiedene Reaktionsmechanismen wurden bereits postuliert, jedoch noch nicht schlüssig bewiesen. Da die Methylierung sowohl die Bioverfügbarkeit als auch die Toxizität der anorganischen Ausgangsstoffe stark verändert, ist ein komplettes Verständnis der zu Grunde liegenden Mechanismen von hoher Wichtigkeit für eine schlüssige Risikoabschätzung. Daher wurden neue Ansätze und Analysetechniken entwickelt, validiert und verwendet, um ein besseres Verständnis des Methylierungsprozesses von As, Sb, Te, Se und Bi durch CH3Cob zu ermöglichen. Besonders Augenmerk lag dabei auf dem toxikologisch hoch relevanten As, welches ein weit verbreiteter Umweltschadstoff im Trinkwasser ist. Bezüglich der Methylierung von Metall(oid)en durch Methanoarchaen, wurde die Rolle von Cob(I)alamin (Cob(I)) in diesem Prozess genauer untersucht, da in der Literatur dessen katalytische Rolle in Betracht gezogen wurde – Cob(I) wird intermediär durch den MtaA-katalysierten Transfer der Methylgruppe von CH3Cob zu Coenzym M (CoM) im Laufe der methylotrophen Methanogenese gebildet. Untersuchungen mittels UV/Vis-Spektroskopie sowie Gaschromatographie (GC) nach Purge&Trap (P&T) in Verbindung mit induktiv gekoppeltem Plasma Massenspektrometrie (ICP-MS) führten zu der Erkenntnis, dass Cob(I) den Transfer der Methylgruppe von CH3Cob zu den Metall(oid)en induziert. Da dies belegt, dass biologische Elektronenüberträger bedeutende Faktoren für die Befähigung zur Methylierung der Methanoarchaeen sind, wurde die Effizienz der abiotischen Methylierung von As, Sb, Se,Te und Bi durch CH3Cob in Gegenwart von Glutathion (GSH) als wichtigem Kofaktor in vielen Bakterien und Eucaryoten untersucht. Zum Vergleich wurde die Methylierung in Gegengenwart von CoM oder Titancitrat, das oft in biochemischen Assays eingesetzt wird, sowie die Photomethylierung exemplarisch an As untersucht. Da alle untersuchten „Bioreduktionsmittel“ den Transfer der Methylgruppe von CH3Cob zu As induzieren konnten, legt dies nahe, dass verschiedene Bioreduktionsmittel in Abhängigkeit von ihrer Verfügbarkeit zur Methylierung in vivo beitragen können. Zur detaillierteren Untersuchung des Reaktionsmechanismus der MtaA-vermittelten Methylierung von As durch CH3Cob wurde eine neue Oxidationsstufenspezifische Hydridgenerierung (HG) in Verbindung mit Analyse via GC-ICP-MS entwickelt. Die effiziente Methylierung nur der dreiwertigen Arsenspezies ohne Änderung der Oxidationsstufe deutete darauf hin, dass der Transfer der Methylgruppe über eine nicht-oxidative Methylierung erfolgt. Des Weiteren zeigten detaillierte UV/Vis und P&T-GC-ICP-MS Analysen, dass es sich wahrscheinlich um einen ähnlichen Mechanismus für Se, Sb, Te und Bi handelt und dass der Methyltransfer mittels einer konzertieren nukleophilen Substitution oder in einem „caged“ Radikalmechanismus erfolgen muss. Ein anderer Ansatz zur Untersuchung der Biomethylierung und Aufklärung der Reaktionsmechanismen ist die Analyse der Kohlenstoff-Isotopenfraktionierung während des Transfers der Methylgruppe zum Metall(oid). Anhand der Größe des auftretenden kinetischen Isotopeneffektes (KIE) lassen sich beispielsweise eine konzertierte und eine schrittweise nukleophile Substitution voneinander unterscheiden. Daher wurde die erste Methode entwickelt, um das Kohlenstoffisotopenverhältnis von metall(loid)organischen Verbindungen in einer komplexen Matrix bestimmen zu können. Die Methode nutzt die selektive HG der Organometall(oid)e zur Volatilisierung und Matrixabtrennung gefolgt von P&T-Anreicherung, Heart-Cut Gaschromatographie und Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS). Die Anwendbarkeit der Methode wurde anhand der Analyse eines mit Trimehylarsenoxid belasteten Kompostes gezeigt. In einem weiteren Schritt wurde die Methode für die Analyse der niedrig siedenden teilmethylierten Arsenverbindungen erweitertet und optimiert. Um letztendlich den KIE untersuchen zu können, muss der Startwert, das Isotopenverhältnis der zu transferierenden Methylgruppe, bestimmt werden. Aufgrund der hohen Bedeutung des Isotopenwertes wurden mehrere voneinander unabhängige Verfahren für die positions-spezifische Isotopenanalyse von CH3Cob angewendet – Abstraktion der Methylgruppe mittels HI, Licht, erhöhter Temperatur sowie Pt (II/IV) und anschließende Analyse der Reaktionsprodukte mittels GC IRMS oder Fließinjektionsanalyse (FIA)-IRMS im Falle von Pt. Mittels der entwickelten IRMS Techniken wurde schließlich die abiotische Methylierung von Arsenit in Gegenwart von GSH durch CH3Cob untersucht. Der ermittelte KIE deutet dabei auf eine konzertierte Reaktion hin. Insgesamt liefert diese Doktorarbeit neue Erkenntnisse auf dem Gebiet der Biomethylierung und darüber hinaus bieten die entwickelten Techniken neue Möglichkeiten die Methylierung von Metall(oid)en in der Umwelt zu untersuchen.